分子诊断技术原理

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来源：中为咨询www.zwzyzx.com 【日期：2016-05-16 10:08:17】【打印】【关闭】

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分子诊断的主要技术有核酸提取方法、核酸分子杂交、核酸扩增技术。

1.核酸提取方法

传统的DNA提取方法是一般先破碎细胞，用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，而核酸保留在水相中，加入RNA酶去除RNA，最后用异丙醇、乙醇把DNA从提取液中沉淀出来。

磁珠法提取核酸

而磁珠法核酸提取，通过超顺磁性氧化硅纳米磁珠与核酸分子特异性地识别和高效结合，在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能将核酸从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出来。相比传统的核酸提取方法，磁珠法核酸提取具有自动化、高通量、操作简单、用时短、安全无毒、提取的核酸纯度高等特点。

2.核酸分子杂交技术

具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程，称为核酸分子杂交。杂交的双方是待测核酸序列和探针序列，通过检测核酸探针序列上的标记物，来反映待测核酸序列的含量。探针的标记需要高灵敏性、不影响碱基配对的特异性、不影响探针分子的主要理化性质、对酶促反应活性无影响、检测方法具有高灵敏性和特异性。标记方法包括32P、35S和3H等核素标记物及生物素、荧光素或者化学放光探针等非核素标记物。

核酸分子杂交技术包括固液杂交和液相杂交，固液杂交则包含膜上印记杂染（Southern和Northern）和原位杂交；液相杂交则包括RNA酶保护分析法及核酸酶S1保护分析法等。

核酸分子杂交技术分类

3.核酸扩增技术

核酸扩增是一大类技术方法的总称，目前包括常规PCR、实时荧光定量PCR和等温核酸扩增技术等。

常规PCR

聚合酶链反应(即polymerasechainreaction，PCR)原理：PCR是模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)在DNA聚合酶作用下发生酶促聚合反应，扩增出所需目的DNA。包括三个基本步骤：

双链DNA模板加热（90-96℃）变性成单链(变性Denature)；

在低温（50℃左右）下引物与单链DNA互补配对(退火Annealing)；

在适宜温度下TapDNA聚合酶催化引物沿着模板DNA延伸Elongation。

由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。

PCR反应原理示意图

定量PCR技术

实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA或者cDNA的起始浓度进行定量的方法，实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA或cDNA拷贝数最敏感、最准确的方法。

对实时定量PCR标记的荧光基团包含有以SYBR染料为代表的非特异性荧光标记（仅与DNA双链结合）、以及以Taqman探针为代表的特异性荧光标记（利用荧光能量共振转移FRET技术来进行检测）。

.荧光染料

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，可以通过溶解曲线确定PCR反应是否特异。

荧光探针

将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

定量PCR荧光探针检测原理

实时定量PCR技术无需杂交检测，可以实时检测结果，加快了检测的速度，只需要1-2小时的时间就能得到检测结果。但在进行多种病原体检测的时候，需要向同一体系中加入多种病原体的特异性引物，由于不同PCR引物扩增效率、反应体系不同等问题，定量PCR非常难以应用于多重检测。

等温核酸扩增技术

恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术，扩增反应的全过程（除初始的杂交步骤外）均在单一温度，无需专门的扩增仪器下进行。目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。

其中依赖核酸序列扩增与环介导等温扩增是相对稳定的技术，应用较多。

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