ctDNA的富集的方法

来源：中为咨询www.zwzyzx.com 【日期：2016-08-11 11:29:31】【打印】【关闭】

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ctDNA富集方法

血液中含有大量游离在细胞外的核酸（cfDNA），不仅包括来自肿瘤的核酸（ctDNA），还包括其他来源的核酸。在检测ctDNA的第一步就是将cfDNA从血液中抽提出来。由于ctDNA浓度低而且高度碎片化，富集和分离就显得尤为重要。一般我们需要5-10mL血液，收集后，取血清或血浆分离cfDNA。血液经抗凝处理后的全部血液为全血；离心除去血细胞后所得到的淡黄色液体为血浆。血液不经抗凝处理，自行凝固后，血液除凝固的部分以外的清澈淡黄色的液体就是血清。虽然血清中ctDNA的浓度是血浆中的3-24倍，但是凝血过程中容易产生的杂质污染。相比之下，用血浆提取DNA使用更广泛。由于血液中DNA酶的存在，使得cfDNA在血液中不稳定，易被降解。分离DNA应在抽血后的数小时内完成。常用于分离ctDNA的方法有两种：

离心柱法以硅胶滤膜作为固相载体的，基于二氧化硅选择性结合DNA的独特属性。其原理是带负电的DNA骨架与带正电的硅胶滤膜之间的高亲和力。钠离子起到阳离子桥的作用，它可以吸引核酸磷酸骨架里带负电荷的氧。在高盐条件（pH≦7）下,钠离子可破坏水中的氢与硅中带负电荷的氧之间的氢键。通过大量漂洗去掉所有杂物后，用TE或Tris-Hcl缓冲液或蒸馏水在低离子强度下（pH≧7）洗脱纯化的DNA。

磁珠法带有磁荷的颗粒可通过磁场中的永磁将其移除。这些磁颗粒可用表面包被活性基团的氧化铁颗粒制成。因表面积大，结合核酸的能力较强，可作为较好的分离载体。如果赋予容器侧壁磁性，样品混合物中结合有核酸的磁珠则聚集到容器壁，直接倾倒容器可将其他杂质去除，避免了反复离心。磁珠表面包被有活性基团可特异性吸附核酸。磁珠分离技术是现今核酸纯化的一种简单快速的方法。

游离核酸的常用提取方法比较

cfDNA检测一般采用虑柱法，因为提取效率高，而且cfDNA测序所需的外周血量大，一般为5mL-10mL；磁珠法可以用于NIPT的检测，因为母体中胎儿游离的DNA量比较丰富，可以达到母体外周血中cfDNA总量的10%，磁珠法的优势是简单快速。目前来看，分离和富集血液中的cfDNA并不是瓶颈，市面上有很成熟的试剂盒可以抽提得到足量的cfDNA。瓶颈主要在于之后的ctDNA的检测与分析。

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